ENZIMOLOGIA 1: PRINCIPI DI BASE; ENZIMI AD UN SOLO SUBSTRATO; LORO INIBITORI 1. La cinetica chimica e la catalisi sono state spiegate nel corso di Chimica e Propedeutica Biochimica; e' molto consigliabile rileggere la spiegazione pertinente al link qui fornito. 2. Gli enzimi sono catalizzatori biologici molto specifici. Gli enzimi sono proteine capaci di catalizzare reazioni chimiche di interesse per il metabolismo. Sono molto specifici: ogni enzima catalizza una sola reazione chimica su un solo reagente o su pochi reagenti tra loro simili. Il reagente delle reazioni catalizzate da enzimi prende il nome di substrato dell'enzima. Le reazioni biochimiche, alla temperatura corporea sono estremamente lente; in pratica si puo' affermare che in assenza dell'enzima non avverrebbero affatto. L'enzima, combinandosi in modo transitorio con il reagente della reazione, fornisce un meccanismo di reazione che ha energia di attivazione piu' bassa di quella della reazione non catalizzata: Come ricordiamo dal corso di Chimica e Propedeutica Biochimica, la legge di Arrhenius correla la costante cinetica con l'energia di attivazione: k = A e-Eatt/RT pertanto se l'energia di attivazione diminuisce la costante cinetica aumenta e la reazione avviene piu' rapidamente. 3. Enzimi ad un solo substrato. Sono i piu' semplici da studiare e descrivere, ma costituiscono una minoranza (la maggioranza degli enzimi catalizza reazioni che richiedono due substrati). Esempi di questo tipo di enzimi sono le isomerasi e le idrolasi. Esempi di reazioni di questo tipo sono: gliceraldeide-3-fosfato <==> diidrossiacetone fosfato (enzima: trioso fosfato isomerasi) maltosio + H2O --> 2 glucosio (enzima: maltasi) 4. E' interessante confrontare l'andamento temporale della reazione e la dipendenza della sua velocita' dalla concentrazione di substrato in presenza ed in assenza dell'enzima: In assenza dell'enzima la reazione irreversibile S --> P procede con l'andamento esponenziale caratteristico delle reazioni di I ordine (d[P]/dt = -d[S]/dt = [S0] e-kt); in presenza dell'enzima, almeno inizialmente, la reazione procede con un andamento molto piu' veloce e apparentemente lineare (ordine zero; -d[S]/dt = k't). Inoltre se viene misurata la velocita' iniziale in funzione della concentrazione iniziale del substrato ([S0]), in assenza dell'enzima si ha una dipendenza lineare di Vi da [S0]; in presenza di enzima la dipendenza segue una funzione iperbolica, con asintoto Vmax e punto mediano (KM, Vmax/2). 5. La dipendenza iperbolica, che ricorda l'equilibrio chimico invece della cinetica fu spiegata da Michaelis e Menten ricorrendo all'ipotesi che l'enzima formi un complesso instabile con il substrato (complesso di Michaelis). Il modello di Michaelis e Menten e' stato spiegato nel Corso di Chimica e Propedeutica Biochimica. L'equazione di Michelis e Menten (vedi sotto) e' valida soltanto per le condizioni di stato stazionario, nelle quali le concentrazioni delle diverse specie chimiche dell'enzima (E ed ES) sono (approssimativamente) costanti. 6. L'iperbole di Michaelis e Menten può essere linearizzata nel grafico dei doppi reciproci, di Lineweaver e Burk. In origine il motivo di questa trasformazione era quello di facilitare l'analisi in un epoca nella quale i computers non erano disponibili; ma la rappresentazione è entrata nell'uso ed è tuttora utilizzata anche se introduce distrosioni nella rappresentazione dell'errore sperimentale. la trasformazione è la seguente: Michaelis e Menten: V = Vmax [S] / (KM + [S]) Lineweaver e Burk: 1/V = 1 / Vmax + KM / Vmax [S] Si vede che il grafico di 1/V in funzione di 1/[S] e' una retta con intercetta 1/Vmax e coefficiente angolare KM/Vmax. Il termine Vmax/KM e' il coefficiente angolare della tangente del tratto iniziale dell'iperbole di Michaelis e Menten, ed il reciproco del coefficiente angolare della retta di Lineweaver e Burk; se normalizzato per la concentrazione totale dell'enzima, [Etot], ci da la costante di specificità dell'enzima, kcat/KM, un parametro fisico importante (bisogna ricordare che Vmax = [Etot] kcat). 7. Un esempio di meccanismo catalitico: le proteasi a serina. Dal punto di vista del meccanismo di reazione, ogni enzima e' un caso a se; ciononostante e' importante avere in mente almeno un esempio di un meccanismo di reazione. Uno dei casi meglio studiati e' quello delle proteasi a serina come tripsina, chimotripsina, etc. che idrolizzano i legami peptidici interni alle molecole proteiche nel corso dei processi digestivi. L'enzima possiede nel sito attivo la "triade catalitica" His-Asp-Ser. Quando reagisce col substrato forma un intermedio tetraedrico instabile (non rappresentato in figura) che evolve nel complesso covalente dell'acil-enzima, nel quale la Ser e' legata alla meta' amino-terminale del peptide con legame estere; la meta' carbossi-terminale viene rilasciata. Una molecola d'acqua entra nel sito e grazie all'interazione con l'His viene favorita l'idrolisi del legame estere attrverso un nuovo intermedio tetraedrico. A questo punto anche la meta' amino-terminale del peptide viene rilasciata e l'enzima può svolgere un nuovo ciclo catalitico. Si nota che gli intermedi "interni" del ciclo sono numerosi e che il modello di Michaelis e Menten e' una semplificazione in quanto ipotizza un solo ed unico evento di conversione di S in P. 8. Effetto del pH. Nel meccanismo di molti enzimi intervengono eventi di catalisi acido-base (estrazione o donazione di ioni idrogeno). In questi casi per la catalisi sono essenziali residui aminoacidici dissociabili (nell'esempio delle proteasi a serina His 57 e Asp 102). Se lo stato di protonazione di questi residui viene alterato cambiando il pH della soluzione, la catalisi diventa meno efficiente e soltanto la frazione di enzima che si trova negli stati di protonazione "giusti" risulta attivo. Pertanto l'attività di quasi tutti gli enzimi presenta una dipendenza dal pH con un valore ottimale prossimo a quello presente nell'ambiente in cui l'enzima deve svolgere la sua funzione fisiologica; al di sopra o al di sotto di questo valore in genere l'attività dell'enzima diminuisce fino ad annullarsi. Ad esempio la tripsina presenta un pH ottimale di 7.2-7.6. 9. Catalisi enzimatica di reazioni reversibili. Quando la reazione chimica catalizzata dall'enzima e' reversibili, come accade di frequente (si pensi al caso delle isomerasi che convertono tra loro due isomeri), l'enzima accelera il raggiungimento della condizione di equilibrio, ma non cambia il valore della costante. Questo implica che la reazione procede sempre nella direzione indicata dalla sua costante di equilibrio; se l'organismo ha bisogno di mandarla nella direzione opposta, deve utilizzare meccanismi specifici, ad es. accoppiamento con idrolisi di ATP, o con ossidazione di NADH; oppure deve rimuovere il prodotto di reazione con un'altra trasformazione, piu' vantaggiosa, e mantenere la concentrazione del prodotto al di sotto del suo valore di equilibrio. Questo accade ad esempio nella glicolisi per la trasformazione di P-enolpiruvato in enolpiruvato (energeticamente svantaggiosa) seguita dalla trasformazione di enolpiruvato in piruvato (vantaggiosa). 10. Inibizione. Ogni cellula possiede un nutrito corredo enzimatico, e alcuni enzimi vengono secreti per agire nell'ambiente extracellulare. Può accadere che l'attività degli enzimi presenti in un certo distretto risulti in certi momenti non necessaria o addirittura dannosa, sebbene sia utile che l'enzima rimanga disponibile per poter essere rapidamente utilizzato nel momento in cui risultasse necessario. Un esempio di questa condizione e' dato dagli enzimi della coagulazione: devono essere costantemente presenti nel sangue per poter intervenire istantaneamente in caso di emorragia, ma non devono essere attivi finche' l'emorragia non si verifica. La soluzione a questo problema e' l'inibizione enzimatica: la presenza di una piccola molecola capace di formare un complesso reversibile con l'enzima e di bloccarne temporaneamente l'attivita'. Esistono due tipi fondamentali di inibizione enzimatica: competitiva e non competitiva, quest'ultima pero' con diverse possibili varianti. 11. Inibizione competitiva. L'inibitore competitivo in genere si combina con l'enzima a livello del sito attivo impedendo l'accesso del substrato. A causa di questa modalita' di combinazione il substrato e l'inibitore sono mutuamente esclusivi e non si puo' formare il complesso ternario enizma-inibitore-substrato. Lo schema di reazione e': Se la reazione di combinazione e dissociazione dell'inibitore sono rapide rispetto a quelle del ciclo catalitico, il sistema può essere trattato sotto l'approssimazione dello pseudo-equilibrio e si puo' esprimere la concentrazione della specie EI come una funzione della specie E: [EI] = [E] [I] / KI dove KI e' la costante per l'equilibrio di dissociazione del complesso EI. La concentrazione del complesso ES rimane, come per il modello di Michaelis e Menten in assenza di inibitore: [ES] = [E] [S] / KM Pertanto il polinomio di legame, scritto rispetto ad [E], risulta: [Etot] = [E] (1 + [S]/KM + [I]/KI Sotto questa approssimazione, l'equazione di Michaelis e Menten assume questa forma: V = [ES] k3 = [Etot] [S] k3 / ([S] + KM(1 + [I]/KI)) Questa equazione descrive una iperbole equilatera analoga a quella di Michaelis e Menten, ma governata da una KM apparente, che corrisponde alla vera KM dell'enzima misurata in assenza dell'inibitore, moltiplicata per il termine correttivo (1 + [I]/KI). Se la concentrazione di substrato viene aumentata molto fortemente, idealmente fino a tendere ad infinito, i termini che non contengono [S] diventano trascurabili e la Vmax risulta uguale a [Etot] k3, identica a quella che si può misurare in assenza dell'inibitore; pertanto l'inibitore competitivo aumenta il valore di KM e lascia invariato quello di Vmax. Questa proprieta' dell'inibitore competitivo e' molto importante dal punto di vista fisiologico perche' quando e' presente l'inibitore il substrato si accumula e alla fine sposta l'inibitore dal sito attivo e rimuove l'inibizione: il sistema risulta protetto dall'avvelenamento che l'inibitore potrebbe causare (l'inibizione competitiva e' un caso di identical linkage). I grafici di Michaelis e di Lineweaver per un caso di inibizione competitiva sono i seguenti: 12. Inibizione non competitiva pura. Nell'inibizione non competitiva, l'inibitore si lega ad un sito diverso dal sito attivo e si può formare il complesso ternario EIS. Se l'inibizione non competitiva e' "pura" non c'e' linkage tra inibitore e substrato e l'enzima ha la stessa affinita' per l'inibitore in presenza ed in assenza del substrato. Purche' le reazioni di combinazione e dissociazione dell'inibitore siano rapide rispetto a quelle del ciclo catalitico, e' possibile scrivere un polinomio di legame, che risulta: [ES] = [E] [S] / KM [EI] = [E] [I] / KI [EIS] = [E] [I] [S] / KM KI [Etot] = [E] (1 + [S]/KM + [I]/KI + [S][I]/KMKI) Dal polinomio si ricava la legge cinetica: V = [ES] k3 = [Etot] [S] KI k3 / (KMKI + [S]KI + [I]KM + [S][I]) Raccogliendo a fattor comune i termini che contengono [S] e quelli che non lo contengono, si ottiene: V = [Etot] [S] KI k3 / ([S]([I] +KI) + KM([I] +KI)) Questa equazione ci dimostra che l'inibitore non competitivo puro obbedisce ad una equazione di Michaelis moltiplicata per il termine KI / ([I] + KI): V = KI/([I] + KI) [Etot] [S] k3 / ([S] + KM) Ovvero: l'inibitore non competitivo puro cambia la Vmax dell'enzima ma non sua la KM. Una conseguenza importante di questo meccanismo e' che un eccesso di substrato non puo' spostare l'inibitore, ma al massimo spinge l'enzima verso la specie inattiva EIS; questo può portare all'intossicazione cellulare (e infatti gli inibitori non competitivi sono in genere veleni cellulari. I grafici di Michaelis e di Lineweaver per un inibitore non competitivo puro sono i sguenti: 13. Inibizione incompetitiva. L'inibizione incompetitiva o non competitiva e' un caso di heterotropic linkage. Lo schema di reazione e' il seguente: In questo caso il complesso ternario EIS si forma, come accade per l'inibizione non competitiva pura, ma la presenza del substrato cambia l'affinita' dell'inibitore e viceversa. La specie EIS può essere completamente inattiva (cioe' k3' = 0) o può mostrare una attivita' inferiore alla specie ES (cioe' k3' < k3). Semre assumendo la rapidita' delle reazioni di combinazione e dissociazione dell'inibitore, si può scrivere il seguente polinomio di legame: [ES] = [E] [S] / KM [EI] = [E] [I] / KI [EIS] = [E] [S] [I] / KM KI' [Etot] = [E] (1 + [S]/KM + [I]/KI + [S][I]/KM KI') = = [E](KMKIKI' + [S]KIKI' + [I]KMKI' + [S][I]KI) / (KMKIKI' ) La legge che descrive la velocità della reazione catalizzata, nell'assunzione che l'inibitore sia un vero inibitore e provochi k3' = 0, risulta: V = [Etot][S]KIKI'k3 / (KMKIKI' + [S]KIKI' + [I]KMKI' + [S][I]KI) = = [Etot][S]KIKI'k3 / ([S]KI([I] + KI') + (KMKI'([I] + KI)) Questa equazione non e' ulteriormente semplificabile e ci dimostra che l'inibitore incompetitivo cambia sia la KM che la Vmax; la direzione del cambiamento e' sempre verso una diminuzione della Vmax, mentre la KM può sia aumentare che diminuire: Ricordando che tutte le costanti di equilibrio, come la KM sono definite per la direzione della dissociazione del complesso, possiamo affermare che: se KI' < KI il legame del substrato favorisce l'inibitore e viceversa, quindi la KM apparente in presenza dell'inibitore sara' minore della KM misurata in assenza dell'inibitore; se KI' > KI il legame del substrato riduce l'affinita' dell'inibitore l'inibitore e viceversa, quindi la KM apparente in presenza dell'inibitore sara' maggiore della KM misurata in assenza dell'inibitore.