INTERAZIONE TRA PROTEINE E LIGANDI

1. L'interazione tra proteine e piccole molecole (e non solo) e' un aspetto fondamentale dei processi biologici: include ad esempio il riconoscimento degli ormoni da parte dei recettori, la catalisi enzimatica, il trasporto di sostanze da un punto all'altro della cellula o dell'organismo, le reazioni tra antigeni e anticorpi, le reazioni tra farmaci e loro bersagli, etc.

2. Le reazioni chimiche di combinazione delle proteine con i loro ligandi sono governate dalla legge di azione delle masse, gia' vista a proposito dell'equilibrio chimico. In pratica:
PX <==> P + X
Kd = [P] [X] / [PX]
[PX ] / [P]tot = [X] / (Kd + [X])
L'ultima equazione dimostra che la frazione di saturazione della proteina con il ligando, che può variare tra 0 e 1, e' una funzione iperbolica della concentrazione del ligando libero.
L'ultima equazione ci consente di definire la concentrazione di ligando necessaria per ottenere una qualsiasi frazione di saturazione della proteina (espressa come un multiplo o sottomultiplo della Kd). Ad esempio la X50, concentrazione di ligando libero necessaria per ottenere la semisaturazione ([PX]/[P]tot = 0,5) risulta:
X50 = Kd

3. L'interazione tra la proteina ed il ligando avviene in corrispondenza di una parte ben definita della struttura proteica, di solito una cavitĂ  aperta verso la superficie, chiama ta il sito di legame.

4. Nella cellula (o nei nostri esperimenti) possono essere presenti piu' ligandi per la stessa proteina che si combinano con lo stesso sito di legame o con siti diversi. Il rapporto tra proteine e ligandi in questi casi e' descritto come un linkage tra ligandi diversi.

5. Identical linkage: e' il caso nel quale il sistema contiene due ligandi che si legano in modo reciprocamente esclusivo allo stesso sito della proteina:
PY + X <==> P + Y + X <==> PX + Y
In questo modo di reazione non e' possibile la formazione del complesso ternario PYX. La proteina avra' affinita' (cioe' costante di equilibrio) diversa per i due ligandi e si parlera' di specificita' per indicare la capacita' della proteina di preferire l'uno o l'altro.

6. Heterotropic linkage; e' il caso nel quale il sistema contiene due ligandi che si legano a siti diversi della stessa proteina, in modo non mutuamente esclusivo. In questo caso e' possibile la formazione del complesso ternario PYX.

7. Homotropic linkage si verifica se la stessa proteina puo' legare piu' di una molecola dello stesso ligando:
P + 2 X <==> PX + X <==> PX2
In genere le proteine capaci di questo tipo di linkage sono costituite da piu' subunita', tra loro uguali o almeno simili, e presentano una struttura quaternaria con interfacce isologhe (simmetriche). Il caso piu' comune e' quello delle proteine dimeriche. Questo caso sara' trattato in una lezione successiva.

8. Un trattamento piu' approfondito dei fenomeni di linkage si puo' trovare questo link.

9. Miscele di isoforme. In alcuni casi la cellula produce piu' di una sola proteina dello stesso tipo: ad esempio l'enzima lattico deidrogenasi e' presente in due varianti, codificate da geni distinti (per un ancestrale evento di duplicazione genica e divergenza mutazionale), e chiamate H (prevalente nel cuore, heart) e M (prevalente nel muscolo scheletrico). In questi casi ognuna delle due isoforme si combina con lo stesso ligando e la curva di saturazione e' data dalla somma pesata delle curve di saturazione di ciascuna isoforma.

10. Grafici logaritmici e misure di pendenza: al punto 2 e' stato dimostrato che la frazione di proteina combinata con il ligando e' una funzione iperbolica della concentrazione del ligando. Se la stessa relazione viene posta in grafico riportando la concentrazione del ligando su una scala logaritmica, l'iperbole si trasforma in una sigmoide simmetrica il cui punto centrale ha coordinate (log X50 , 0,5). Il tratto centrale della sigmoide puo' essere approssimato ad una retta della quale e' possibile ed utile stimare la pendenza. Utilizzando le formule riportate nel precedente punto 2, si possono infatti stimare le concentrazioni di ligando necessarie per ottenere due valori di saturazione simmetrici rispetto al punto mediano della sigmoide; ad esempio:
[PX]/[P]tot = 0,25 richiede [X] = Kd / 3
[PX]/[P]tot = 0,75 richiede [X] = 3 Kd
Ovvero: per passare da una razione di saturazione pari ad 1/4 della proteina totale ad una pari a 3/4 occorre incrementare la concentrazione del ligando libero di 9 volte, da 1/3 della Kd a 3 volte la Kd. Purche' le frazioni di saturazione scelte siano simmetriche rispetto al punto mediano della sigmoide, questi valori sono indicativi della pendenza massima della stessa (che per una proteina con un solo sito per il ligando e' costante e di poco superiore a 0,5).
Un'altra misura di pendenza del grafico di legame fu proposta dal fisiologo inglese (e premio Nobel) A.V. Hill nel 1911. Il grafico di Hill ha questa forma:
log ([PX]/[P]) = n log ([X]) - log (Kd)
Per una proteina che ha un solo sito di legame n (il coefficiente di Hill) e' obbligatoriamente uguale ad 1.