La titolazione della CO
2
in acqua, nel plasma e nel sangue
Principi generali.
Il sangue contiene molte sostanze con azione tampone, sia di tipo basico (soprattutto i residui di His delle proteine) che di tipo acido (soprattutto bicarbonato e fosfato). La concentrazione di ione idrogeno in soluzione e' sempre minima, nell'ordine delle decine di nM, e pertanto si puo' assumere che gli equilibri acido-base siano sempre e soltanto scambi di ioni idrogeno tra tamponi diversi, ignorando il contributo dato dallo ione idrogeno (o idronio). E' possibile semplificare il sistema considerando due soli tamponi: l'anidride carbonica/bicarbonato (con la sua costante di dissociazione acida Kc) e la somma dei tamponi non carbonici, ai quali viene assegnata una costante di dissociazione acida "media" Kb. Le reazioni del sistema possono pertanto essere descritte come:
Queste espressioni sono valide tanto
in vivo
quanto
in vitro
pero', a causa dell'elevato numero di incognite, possono essere risolte soltanto introducendo considerazioni ulteriori, che variano a seconda della condizione fisiologica considerata o dell'esperimento effettuato
in vitro
.
La titolazione del tampone bicarbonato/CO
2
e' stata eseguita in vari modi; il suo interesse per la medicina e' evidente per il ruolo della CO
2
nei tamponi del sangue (nel quale pero' e' accompagnata da altri tamponi e titolata insieme con quelli). In questa esercitazione analizzeremo tre metodi di titolazione che danno risultati molto diversi tra loro:
1) la titolazione dei due tamponi ottenuta cambiando la PCO
2
; in questo caso e' costante la somma delle specie deprotonate dei due tamponi: Sdp = [HCO
3
-
] + [B].
2) La titolazione dei due tamponi con HCl o NaOH a PCO
2
costante.
3) La titolazione dei due tamponi con HCl o NaOH in assenza di fase gassosa (a CO
2
totale costante).
Per semplicita' considereremo un volume di 1 litro di acqua o di plasma "separato" (cioè purificato dai globuli rossi), in modo tale che molarita' e numero di moli coincidano ed esprimeremo le nostre grandezze in mmoli/L o in mmHg. Considereremo condizioni di partenza simil-fisiologiche con pH=7,4; bicarbonato=24 mM; PCO
2
=40 mmHg. Il pKa della CO
2
a T=37
o
C e' 6,1 e la costante di solubilita' della CO
2
e' 0,03 mM/mmHg. Per il
plasma
consideriamo, insieme alla CO
2
un secondo tampone "medio", che rappresenta il contributo di albumina, fosfato, etc. e gli assegniamo pKa=6,8 e [B]
tot
=[BH]+[B]=24 mM. Infine il caso del
sangue
e' analogo a quello del plasma ma richiede un maggiore valore per il tampone B, che tenga conto dell'effetto tampone dell'emoglobina: [B]
tot
(in mEq/L) = Hb (in g/dL) x 4.4 + 15. Inoltre nel caso del sangue e' necessario considerare che la concentrazione totale del bicarbonato è inferiore a quella del plasma a causa del minor contenuto di bicarbonato nei globuli rossi: λ = [HCO
3
-
]
blood
/ [HCO
3
-
]
plasma
= 0,85.
1)
Titolazione con la PCO
2
(a Sdp= cost.)
Un litro di soluzione 24 mM di bicarbonato di sodio e' equilibrato con CO
2
a vari valori di pressione parziale (a T=37
o
C); l'equazione che descrive questo esperimento e':
[H
3
O
] = Kc x 0,03 x PCO
2
/ [HCO
3
-
]
in.
].
Se lo stesso esperimento viene effettuato sul
plasma
, bisogna tener conto anche del secondo tampone. In questo caso lo scambio di ioni idrogeno tra i due tamponi ha questa forma:
CO
2
+ H
2
O + B <=> HCO
3
-
+ BH
+
.
Risulta pertanto costante la somma dei componenti deprotonati dei due tamponi:
Sdp
= [HCO
3
-
] + [B]. Variano invece la PCO
2
e la [CO
2
]
tot
.
L'equazione che descrive questo esperimento ha questa forma:
[H
3
O
] = Kc x 0,03 x PCO
2
/ [HCO
3
-
] = Kb x [BH] / [B]
che puo' essere riscritta secondo la sola variabile B in questo modo:
[H
3
O
] = Kc x 0,03 x PCO
2
/ (Sdp - [B]) = Kb x ([B]
tot
- [B]) / [B].
Si ottiene quindi l'equazione di secondo grado completa in [B]:
Kb [B]
2
- [B] (Kb Sdp + Kb [B]
tot
+ Kc 0,03 PCO
2
) + Kb [B]
tot
Sdp = 0
dalla quale e' facile ricavare [B] e, con questo tutti i parametri del sistema.
Nel caso del
sangue intero
le equazioni sono analoghe a quelle del plasma, ma occorre tenere conto del maggior valore di [B]
tot
che per una [Hb]=14 g/dL risulta [B]
tot
=77 mEq/L; inoltre bisogna rimpiazzare il termine [HCO
3
-
]=(Sdp - [B]) con [HCO
3
-
]=(Sdp - [B]) / λ.
Si ottiene pertanto l'equazione:
Kb [B]
2
- [B] (Kb Sdp + Kb [B]
tot
+ Kc 0,03 PCO
2
λ) + Kb [B]
tot
Sdp = 0
I risultati di questi esperimenti sono i seguenti:
CO
2
in acqua
CO
2
nel plasma
CO
2
nel sangue
PCO
2
(mmHg)
total CO
2
(mM)
pH
total CO
2
(mM)
pH
total CO
2
(mM)
pH
10
24.3
8
21.1
7.95
12.6
7.79
20
24.6
7.7
22.7
7.67
16.3
7.59
30
24.9
7.53
24
7.51
19.2
7.48
40
25.2
7.4
25.2
7.4
21.6
7.4
50
25.5
7.3
26.2
7.32
23.7
7.34
60
25.8
7.22
27.2
7.25
25.5
7.29
70
26.1
7.16
28.2
7.2
27.2
7.25
80
26.4
7.1
29
7.15
28.8
7.22
90
26.7
7.05
29.8
7.11
30.2
7.18
Il potere tampone e' definito per titolazioni nelle quali la concentrazione del tampone e' costante e il titolante non e' l'acido stesso del tampone; ciononostante puo' essere definito il rapporto Δ[CO
2
]/ΔpH che a pH=7,4 risulta: 3 mEq/L per la soluzione acquosa, 3.75 mEq/L per il plasma e 5 mEq/L per il sangue, se misurato sulla PCO
2
e 3 mEq/L per la soluzione acquosa, 12.5 mEq/L per il plasma e 35 mEq/L per il sangue, se misurati sulla CO
2
totale (questi ultimi valori sono simili a quelli che si ottengono con la titolazione con HCl in assenza di fase gassosa).
Confronto coi dati sperimentali:
. Un esperimento classico di titolazione del sangue con la CO
2
fu riportato da
Christensen, Douglas e Haldane
nel 1914 (i punti sperimentali sono riportato come circoli nella figura qui sotto); la linea calcolata secondo il modello qui proposto e' in blu; la linea rossa rappresenta la solubilita' della CO
2
in acqua.
2)
Titolazione con HCl a PCO
2
costante
Un litro di soluzione 24 mM di bicarbonato di sodio o di plasma o di sangue sono equilibrati con PCO
2
=40 mmHg a T=37
o
C e titolati con HCl. Le equazioni chimiche che descrivono questi esperimenti sono le seguenti:
per la soluzione di bicarbonato in acqua: [H
3
O
+
] = Kc x 0,03 x PCO
2
/ ([HCO
3
-
]-[HCl])
per il plasma: [H
3
O
+
] = Kc x 0,03 x PCO
2
/ ([HCO
3
-
] -X) = Kb x (BH + [HCl] - X) / ([B] - [HCl] + X)
per il sangue: [H
3
O
+
] = Kc x 0,03 x PCO
2
/ (([HCO
3
-
] - X) / λ) = Kb x (BH + [HCl] - X) / ([B] - [HCl] + X)
Nota che per [HCO
3
-
] nel sangue si deve prendere il bicarbonato totale.
Si ottengono questi risultati:
CO
2
in acqua
CO
2
nel plasma
CO
2
nel sangue
HCl (mM)
CO
2
totale (mM)
pH
CO
2
totale (mM)
pH
CO
2
totale (mM)
pH
0
25.2
7.4
25.2
7.4
21.5
7.4
2
23.2
7.36
23.5
7.37
20.3
7.38
4
21.2
7.32
21.8
7.34
19.1
7.35
6
19.2
7.28
20.1
7.3
18
7.32
8
17.2
7.22
18.5
7.26
16.9
7.29
10
15.2
7.17
17
7.22
15.9
7.26
12
13.2
7.1
15.5
7.18
14.9
7.23
14
11.2
7.02
14
7.13
14
7.2
16
9.2
6.92
12.6
7.08
13.1
7.17
Il potere tampone a pH=7,4 risulta: Δ[HCl]/ΔpH = 50 mEq/L in acqua, Δ[HCl]/ΔpH = 66.67 mEq/L nel plasma e Δ[HCl]/ΔpH = 100 mEq/L nel sangue.
Confronto coi dati sperimentali
: i valori trovati in questa simulazione si possono confrontare con quelli ottenuti da
Watanabe et al. Japn. J. Physiol. 2001: 51; 671-677
: Δ[HCl]/ΔpH = 90 mEq/L per il sangue a pH=7.4 e PCO
2
= 40 mmHg. Rispetto ai valori di potere tampone ottenuti in assenza di fase gassosa (vedi oltre) questi valori sono fortemente sovrastimati perche' la concentrazione totale del tampone non e' costante e il consumo di bicarbonato non si associa ad un aumento della CO
2
, che e' mantenuta costante dall'equilibrio con a fase gassosa.
I dati sperimentali di Watanabe et al. (su campioni di sangue di molti soggetti) sono riportati sotto forma dell'area grigia nella figura qui sotto; la simulazione ottenuta e' la linea continua nera (si noti che: 1) Watanabe titolava con NaOH anziché HCl; 2) l'anticoagulabnte usato dava reazione acida e per questo il pH iniziale non e'7.4 ma circa 7.1; 3) a valori di pH superiori a 7.8 probabilmente diventano significativi altri tamponbi del sangue, non considerati nel modello: questo e' il limite atteso di un modello che raccoglie tutti i tamponi del sangue sotto un unico valore di pK).
3)
Titolazione con HCl a CO
2 tot
costante (in assenza di fase gassosa)
Un litro di soluzione 24 mM di bicarbonato di sodio o di plasma o di sangue sono equilibrati con PCO
2
=40 mmHg a T=37
o
C; poi un campione del liquido viene trasferito in un recipiente in assenza di fase gassosa e viene titolato con HCl.
Le equazioni chimiche che descrivono questi due esperimenti sono le seguenti:
per la soluzione acquosa: [H
3
O
+
] = Kc x ([CO
2
]i + [HCl]) / ([HCO
3
-
]i - [HCl])
per il plasma: [H
3
O
+
] = Kc x ([CO
2
]i + X) / ([HCO
3
-
]i - X) = Kb x ([BH]i + [HCl] - X) / ([B]i - [HCl] + X)
per il sangue: [H
3
O
+
] = (Kc x 0,03 x PCO
2
+ X) / (([HCO
3
-
] - X) / λ) = Kb x (BH + [HCl] - X) / ([B] - [HCl] + X)
Nota che per [HCO
3
-
] nel sangue si deve prendere il bicarbonato totale; i suffissi "i" indicano i valori iniziali assunti da queste variabili prima dell'inizio della titolazione.
Si ottengono questi risultati:
HCO
3
-
in acqua
HCO
3
-
nel plasma separato dai GR
HCO
3
-
nel plasma di sangue
HCl (mM)
HCO
3
-
(mM)
pH
HCO
3
-
(mM)
pH
HCO
3
-
(mM)
pH
0
24
7.4
24
7.4
24
7.4
1
23
7.12
23.8
7.32
23.9
7.37
2
22
6.94
23.5
7.24
23.8
7.34
3
21
6.8
23.3
7.18
23.6
7.31
4
20
6.69
23
7.12
23.5
7.28
5
19
6.59
22.7
7.06
23.4
7.26
6
18
6.5
22.4
7
23.3
7.23
7
17
6.42
22.1
6.95
23.3
7.2
8
16
6.34
21.8
6.9
23.2
7.18
Questa e' l'unica titolazione nella quale si puo' effettivamente stimare il potere tampone della soluzione rispettando la definizione data da
Van Slyke J. Biol. Chem. 1922
. In queste condizioni il potere tampone a pH=7,4 risulta: Δ[HCl]/ΔpH = 3.57 mEq/L per la soluzione acquosa, Δ[HCl]/ΔpH = 12.5 mEq/L per il plasma e Δ[HCl]/ΔpH = 33.33 mEq/L per il sangue.
Confronto coi dati sperimentali
: i valori trovati in questa simulazione si possono confrontare con quelli ottenuti in assenza di fase gassosa da
Ellison et al., Clin. Chem. 1958: 4; 452-461
: Δ[HCl]/ΔpH = 15-16 mEq/L per il plasma e 31-38 mEq/L per il sangue (si veda la figura qui sotto).
CONSIDERAZIONI FISIOLOGICHE
Quando il sangue arterioso attraversa i capillari sistemici riceve circa 2 mmoli di CO
2
per litro, in assenza di fase gassosa, e si realizza un tipo di titolazione diverso da quelli considerati sopra, per il quale non e' disponibile una vera simulazione sperimentale (che comunque non sarebbe impossibile da realizzare). Le caratteristiche di questo fenomeno sono la costanza di Sdp e CO
2 totale
. E' conveniente prendere come incognita la concentrazione del bicarbonato totale ([X = [HCO
3
-
]
blood
) e scrivere:
[H
3
O
+
] = Kc ([CO
2
]
tot
- X) / (X / λ) = Kb ([B]
tot
- Sdp + X) / (Sdp - X)
Risolvendo per X si ottiene:
X
2
(Kc - Kb /λ) - X (Kc [CO
2
]
tot
+ Kc Sdp + Kb [B]
tot
/λ - Kb Sdp /λ) + Kc [CO
2
]
tot
Sdp = 0
Per calcolare i parametri del sangue venoso utilizzando questa formula dobbiamo conoscere i parametri dell'emogas analisi del sangue arterioso e aggiungere alla [CO
2
]
tot
2 mmoli per litro. Otteniamo:
sangue arterioso
sangue venoso
pH
7,4
7.34
CO
2 totale
(mM)
21.6
23.6
PCO
2
(mmHg)
40
50.1
HCO
3
-
totale
(mM)
20.4
22.1
HCO
3
-
plasma
(mM)
24
26
Il pH venoso ottenuto in questa simulazione e' forse leggermente sottostimato, mentre la PCO
2
venosa e' leggermente sovrastimata perche' non si e' tenuto conto dell'effetto Haldane.
EFFETTO HALDANE
Nelle titolazioni del sangue analizzate in questa simulazione si è assunto che l'emoglobina fosse costantemente ossigenata, come in effetti era usuale nella pratica sperimentale che manteneva una PO
2
costante e prossima a quella dell'aria. In vivo, le variazioni di PCO
2
si associano a variazioni della PO
e a variazioni del grado di saturazione dell'emoglobina. A causa di queste, e dell'effetto Bohr, il valore di alcuni pK dei residui che hanno azione tampone varia; l'ossigenazione si associa a rilascio di ioni idrogeno dall'emoglobina che vengono tamponati (anche) dal bicarbonato. Si verifica quindi l'effetto Haldane:
(H
+
)Hb + O
2
+ HCO
3
-
+ B
plasma
<=> HbO
2
+ CO
2
+ H
2
O + BH
+
plasma
Questo fenomeno aumenta il rilascio di CO
2
nel polmone e l'assorbimento di CO
2
nei tessuti, nonche' il differenziale artero-venoso di CO
2
di un fattore stimato intorno al 30%. In pratica l'effetto Haldane è analogo ad una titolazione del plasma con 0,5 moli di ione idrogeno per mole di ossigeno legato dall'emoglobina a CO
2 totale
= costante e causa il rilascio di circa 0,3-0,5 mmoli di CO
2
in piu' rispetto a quello che avverrebbe in assenza delle variazioni di saturazione dell'emoglobina.
Simulare l'effetto Haldane in condizioni fisiologiche e' alquanto complesso perche' richiede di separare il contributo dell'emoglobina al potere tampone in almeno due componenti, uno per la forma desossigenata, l'altro per la forma ossigenata, che hanno diverso pKa. E' pero' relativamente semplice simulare l'effetto della ossigenazione completa dell'emoglobina in un sistema artificiale chiuso, in assenza di fase gassosa, costruito in modo da assomigliare al sangue.
L'equazione che governa il sistema ha questa forma:
[H
3
O
+
] = Kc ([CO
2
]
tot
- [HCO
3
-
) / [HCO
3
-
] = Kb ([B]
tot
- Sdp + [HCO
3
-
]) / (Sdp - [HCO
3
-
])
In assenza di fase gassosa in questo sistema sono costanti Sdp, [B]
tot
, e [CO
2
]
tot
, mentre è possibile variare la Kb per simulare l'effetto della desossigenazione. Essendo noto il coefficiente di Bohr (circa -0,4 H
+
/O
a pH=7.4) si puo' facilmente calcolare che con 7 residui dissociabili per subunita' il pKb medio della desossiemoglobina deve essere circa pari a 7,05 (Kb di Hb=9x10
-8
M).
Il sistema si risolve nella seguente equazione di secondo grado:
[HCO
3
-
]
2
(Kc - Kb) - [HCO
3
-
] (Kc [CO
2
]
tot
+ KC Sdp+ Kb [B]
tot
- Kb Sdp) + Kc [CO
2
]
tot
Sdp = 0
dalla quale e' facile ricavare [HCO
3
-
] e, da questa, tutte le altre variabili del sistema. Ad esempio e' possibile ricavare la seguente tabella:
stato ossigenato del sistema
stato desossigenato del sistema
pK di Hb
6,8
7,05
pH
7.4 (7.33)
7.63 (7.55)
CO
2
1.21 (1.52) mM
0.73 (0.93) mM
Δ CO
2
0.48 (0.59) mEq/L
PCO
2
40 (50.7) mmHg
24.3 (31) mmHg
HCO
3
-
23.99 (25.68) mM
24.47 mM
CO
2
totale
25.2 (27.2) mM
residui tampone protonati su Hb
12.27 (13.96) mEq/L
12.75 (14.55) mEq/L
residui tampone deprotonati su Hb
49.33 (47.64) mEq/L
48.85 (47.64) mEq/L
residui tampone totali su Hb
61.6 mEq/L
Sdp
73.32 mEq/L
In parentesi i valori che si ottengono dopo aggiunta di 2 mmoli/L di CO
2
in assenza di fase gassosa. Si noti che l'effetto Haldane misurato sulla completa desossigenazione dell'emoglobina ha un effetto maggiore dell'aggiunta di 2 mmoli/L di CO
2
(la quantita' di CO
2
fisiologicamente rilasciata nel sangue venoso).
Questa simulazione
in vitro
dimostra che l'ossigenazione dell'emoglobina causa diminuzione del pH e aumento della PCO
2
, ma non considera il fatto che nel capillare venoso viene rilasciata CO
2
: infatti la desossigenazione dell'emoglobina
in vivo
si associa ad aumento della PCO
2
e della CO
2
totale (che in questa simulazione era mantenuta costante). Si noti che in questa simulazione si e' ipotizzata una soluzione di emoglobina in acqua alla concentrazione di 14 g/dL insieme a 25,2 mmoli/L di anidride carbonica totale; mancano quindi il contributo al potere tampone totale dato dalle proteine plasmatiche e dai fosfati (gli unici tamponi sono Hb e CO
2
) e manca il fattore λ che descrive il rapporto tra il bicarbonato plasmatico e quello totale.